Sekventering af positive cytomegalovirus prøver fra transplantationspatienter med mistanke om resistens til kortlægning af resistensmutationer
Problem
Infektion med cytomegalovirus (CMV) er et problem hos transplantationspatienter, da de får immunsupprimerende medicin. CMV positive patienter bliver derfor behandlet med et antiviralt middel med ledsagende risiko for udvikling af resistens. Ved resistens bør der skiftes til et andet antiviralt middel, som medfører større gener i form af bivirkninger.
Prøver med mistænkt resistens sendes i øjeblikket til sekventering på det svenske herpesvirus referencelaboratorium i Gøteborg, og det er den analyse, vi gerne vil hjemtage. Dette vil give væsentlig hurtigere svar til klinikerne og undgå at patienter får uvirksom eller unødvendig behandling. Vi har det nødvendige udstyr og mangler primært at få dækket udgifter til reagenser og mandetimer til opsætning og validering.
Løsning
Vi vil oprense og sekventere positive CMV prøver fra transplantationspatienter med mistænkt resistens overfor antivirale midler.
Sekventeringen vil foregå vha. Oxford Nanopore teknologien, som vi har arbejdet intensivt med gennem det sidste år til SARS-CoV-2 typning og overvågning. CMV resistens analysen vil være målrettet 5-6 gener med kendte resistens-mutationer. Efter laboratoriedelen vil data blive behandlet bioinformatisk med det formål at kortlægge generne. Resultatet af analysen vil blive sammenlignet med ”The Human Cytomegalovirus Drug Resistance Genotypic database”, som indeholder kendte resistensmutationer. Ved tidligt at opdage begyndende resistens vil man kunne forbedre patientbehandlingen ved at sætte tidligt ind med effektiv antiviral behandling. Man vil ved medicinskift både undgå at patienterne får yderligere, unødige bivirkninger og forhindre yderligere resistensudvikling.
Proces
Fase 1
Beskrivelse: Udvælgelse af gener og tilhørende primere.
Fase 2
Beskrivelse: Indsamling og oprensning af patient prøver. Koncentrationsmålinger vil blive brugt som kvalitetskontrol af prøverne. Testkørsel af de udvalgte primere på de oprensede prøver for at verificere, at der dannes amplicons.
Succeskriterie: Prøverne har positive koncentrationsmålinger og amplicons er velegnede til sekventering ifht. længde og mængde af DNA.
Fase 3
Beskrivelse: Der laves bibliotek fra PCR produkterne som forberedelse til sekventeringen.
Succeskriterie: Tilfredsstillende QC parametre efter oprensning og biblioteksopsætning.
Fase 4
Beskrivelse: Prøverne sekventeres vha. Oxford Nanopore teknologien og analyseres bioinformatisk.
Succeskriterie: Generne opnår høj dækning. Der genfindes resistensmutationer i prøver med kendt resistens. Resultaterne sammenholdes med resultatsvar fra prøverne sendt til det svenske herpesvirus referencelaboratorium i Gøteborg.
